分子生物学

合成抗凝剂

抗凝药物在对抗静脉血栓栓塞中必不可少。根据对天然抗凝剂的分析,化学家合成了新药。

莫里斯·佩蒂图(Maurice 佩蒂图)和让·马克·赫伯特(Jean-Marc Herbert) 科学N°274
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循环系统最常见的疾病是静脉血栓栓塞:它最初表现为位于腿深静脉的静脉炎,然后有时由于血管阻塞或血栓形成而复杂化,其发展过程为一到两步致命的肺栓塞病例百分比。另外,在三分之一的患者中,它会导致血栓形成后综合症,通常非常致残。在工业化国家中,每千人中就有一人受到影响,这种疾病给卫生系统的资源造成了沉重的压力。

原因?血液过度凝集。通常,由于“凝结系统”,这是一组生化反应,其中从非活性前体(凝血酶原)产生的酶(凝血酶和其他“因子”)会保持最佳流动性和其他各种因素)依次激活。这些反应导致血浆蛋白纤维蛋白原的修饰,该蛋白被转化为纤维蛋白(血凝块的重要组成部分)。通常,凝血系统受其他蛋白(包括抗凝血酶)的调控。调节限制了出血和凝血。

由于凝血是血栓形成的原因,因此医生自然使用抗凝化合物作为抗血栓形成剂。有两种方法可以抑制血液凝结。首先是通过限制维生素K的作用来降低血液中凝血因子的浓度,从而确保其生物合成:使用的药物是抗维生素K。

这些产品口服给药,但作用时间很长,因此医生难以避免会引起出血的药物过量:在整个治疗过程中,也就是说有时在生命中,医生会调整剂量。对每位患者进行仔细检查(定期进行血液检查),以了解其抗凝功效和出血风险。另外,抗维生素K的使用有时会因大量药物和食物的相互作用而变得复杂。

减少凝血的第二种方法是阻止引起凝血的因素。直接抑制剂与酶的活性位点结合并抑制酶的活性位点,或者间接抑制剂激活正常的凝血抑制剂:抗凝血酶。

水rud素是当今唯一使用的直接凝血酶抑制剂:该分子是一种小蛋白质(由65个氨基酸组成的链),最初是从水ech的唾液腺中提取的,现在由基因工程。由于其化学性质,该分子只能通过注射给药。各种制药公司正在探索其他直接抑制剂,这些抑制剂是受到蚊子或壁虱的胃中或蝙蝠唾液中存在的肽(甚至较短的氨基酸链)的启发。

我们对间接抑制剂更感兴趣,如我们所见,间接抑制剂之所以如此命名是因为它们通过抗凝血酶起作用。抗凝血酶以相对较高的浓度存在于血液中,具有被变形激活的显着特性:然后限制了凝血。在体内,这种“构象变化”是由血管表面存在的称为硫酸乙酰肝素的碳水化合物家族的分子引起的。 (见图6).

肝素类的间接抑制剂可激活抗凝血酶,类似于硫酸乙酰肝素。它们是在1930年代后期引入的,早于阐明其抗凝作用的机制(这项工作仅在1970年代进行)。

完美分子

肝素最初从牛的肺中提取,如今从猪的肠道中回收,具有立即或非常短期的作用,可防止服用过量。另一方面,使用它们有血小板减少症(循环血小板数量下降)的危险,与直接作用机制引起的低出血风险相比,这种副作用更难以接受。

尽管被广泛使用,但是肝素并不是理想的抗血栓形成剂。让我们检查其结构,以了解其缺陷的根源。该分子通常被称为碳水化合物或糖。对于化学家来说,它是一种多糖,即一串亚基:单糖。这些分子的主链由3到9个碳原子组成,这些碳原子与羟基(-OH)相连,并且经常与各种化学基团相连。 (见图6).

例如,肝素中每隔一个单糖就是一个“糖醛酸”,其中一个氧原子和五个碳原子连接在一个六角环上,该环除了氢原子外还带有:两个羟基和一个羧酸基(–COOH)。肝素中发现的另一种单糖是氨基糖,氨基葡萄糖:六角环带有一个羟甲基(–CH2OH)和一个氨基(–NH2)。由于单糖携带的各种基团,例如磺酸盐基团(–SO3 ),肝素带负电很强,因此通过静电力与许多在体内具有正电荷的蛋白质相互作用。

由于凝血酶是肝素结合的蛋白质之一,长期以来人们认为后者的抗凝活性是由于其电荷。到目前为止,甚至化学家们都通过向各种天然或合成聚合物中添加磺酸盐基团来寻求类似于肝素的新作用分子。它们不仅失败了,而且我们现在知道,太多的电荷会降低抗凝活性。此外,负电荷是肝素治疗(尤其是血小板减少症)引起的副作用的原因,它们通过促进其消除而限制了药物的作用时间。

我们在此报告的工作始于1970年代末,由Jean Choay着手,旨在克服这些种种弊端:我们正在寻求合成抗凝血酶的新活化剂,以获得类似于肝素的凝血作用。 ,而不会产生不良影响。我们将看到已经实现了目标,并且所获得的分子阐明了肝素的作用机理。

减少剂量,同时保持效果

肝素抗血栓形成的第一批临床试验是由瑞典和加拿大团队分别于1936年和1937年进行的:医生得出的结论是肝素是有效的,但有不良副作用,像发烧一样,使病人感到不安,甚至在医院的走廊里,有时甚至都能听到线框的吱吱作响。

我们现在了解到,肝素上存在几个负电荷会促进其与许多生物分子的结合,从而使其纯化变得复杂:以肝素为名出售的制剂是几种类似多糖的混合物,各种生物分子。

然后,在1960年代末,医生观察到减少肝素的剂量并不会降低抗血栓形成的作用。但是,出血的风险大大降低了。同样,在1970年代,制药公司销售“低剂量肝素”。

1974年提出了对这种作用的解释:在每个阶段都放大了一系列酶链反应所产生的凝结作用。因此,当仍然限制放大倍数时,通过作用于上游步骤可以更有效地抑制它。因此,药理学家计算出,激活凝血酶的一微克肝素抑制因子Xa产生的抗凝作用与在下游产生的1000克以上的肝素抑制凝血酶的抗凝作用相同。

这一发现促使生物化学家们在组成肝素制剂的各种分子家族中寻求对Xa因子的抑制作用最强的分子。 1976年,证明了分子量对肝素抗凝特性的影响:在一次实验中,一组瑞典和英国研究人员发现抗Xa因子的活性是不依赖于分子量,而抗凝血酶活性则需要分子量为6000的多糖,该多糖由约20个相连的单糖组成。

该观察结果导致了低分子量肝素类别的发展:由于短寡糖会抑制Xa因子(抗血栓形成作用的关键),因此有必要避免更长的寡糖(包括大量电荷)。造成不良影响。

发现低分子量肝素比初始肝素具有更好的耐受性。另外,这些分子被血管表面吸收的速度较慢,并且在血液中的停留时间更长,因此可以减少注射的频率。通过分馏获得低分子量肝素后,今天通过裂解标准肝素制备低分子量肝素。于1982年在临床上引入,它们代表了所用肝素的一半以上。

但是,许多问题仍然悬而未决。在保持抗Xa因子效应的同时,片段的大小可以减少多远?抑制因子Xa是否足以获得显着的抗血栓形成活性?一些最著名的药理学家对此表示怀疑,因为已经观察到低分子量肝素也能抑制凝血酶,尽管程度不及标准肝素。专有的Xa因子抑制剂是否比低分子量肝素具有更好的耐受性?

1976年,一方面罗伯特·罗森伯格(Robert Rosenberg)和他的同事在波士顿,另一方面,乌尔夫·林达尔(Ulf Lindahl)在乌普萨拉(Uppsala)的团队独立发表了实验结果,这些实验对于进一步发展原子能机构至关重要肝素:肝素制剂中只有三分之一的分子与抗凝血酶结合,并且只有这些链减少了凝血。

外遇的原因

对活性和非活性分子结构的比较分析没有显示出与这些相反行为相关的差异:必须最小。然而,J。Choay和Jean-Claude Lormeau所困扰的最短片段抑制因子Xa的问题变成了:最短的肝素片段对抗凝血酶具有亲和力的结构是什么?并具有抗Xa因子作用?解决方法出现了一个问题:我们必须将肝素片段化,选择与抗凝血酶结合的片段,纯化由此结合的寡糖,最后测试各个部分的抗Xa因子作用。

1981年,我们与米兰的BénitoCasu及其同事合作,确定了一种五糖(由五个单糖链形成的序列,我们命名为DEFGH)的结构,该结构可确保与肝素可抗凝血酶并激活后者。这个顺序 (见图1)特别地包含磺化亚基(F),其对于这种与抗凝血酶的结合是至关重要的(U. Lindahl已经在我们面前观察到)。最近,我们表明抗凝血酶结合的关键是三个DEF亚基。

确定了可激活抗凝血酶并抑制Xa因子的寡糖后,我们掌握了想要合成的分子的结构。同时,这种合成是糖合成的经典问题 (见图5) 还有一个新问题,因为目标寡糖是已获得的最复杂的寡糖:其结构包括原始的单糖和氮或氧原子携带的约十个磺酸盐基团,从而确保了活性分子

化学合成与生物活性

如果化学家迄今忽略了这样的合成,那很大程度上是因为没有向他们提出明确的目标。经过几年的研究,1983年,我们与奥尔良大学的PierreSinaÿ和Jean-Claude Jacquinet合作,从葡萄糖和葡萄糖胺(葡萄糖分子被羟基取代(通过胺基),几毫克所需的低聚糖。

这足以验证我们在肝素与抗凝血酶结合位点上的假设:我们观察到产生的结构对抗凝血酶具有很强的亲和力,并且具有重要的抗Xa活性。然后在动物中评估了该分子的抗血栓形成活性:正如我们希望的那样,该分子是一种强大的抗血栓形成剂。另一方面,对于我们来说,有一天要考虑将其合成为一种药物的时间太长了:它需要连续80次操作!

使用选择性修饰的变体(通常更易于合成),我们已经确定了分子中各种元素在与抗凝血酶结合中的作用。因此,已经清楚地证明了某些磺酸酯基团的功能和重要性,特别是在中央葡糖胺亚基中第3位的那个的关键作用。最近,在剑桥,罗宾·卡雷尔(Robin Carrell)对由抗凝血酶和合成五糖复合物形成的晶体进行了X射线分析。它证实了我们在研究化学结构和活性之间关系时获得的结果。

当我们研究合成五糖与抗凝血酶的相互作用时,我们发现只有磺酸盐基团和羧酸盐基团(-COO-)提供了与蛋白质的直接结合,而我们在合成过程中竭尽全力暂时保护初始单糖的羟基(-OH),以便它们存在于最终分子中。然后,我们验证了在合成开始时阻断这些基团不会阻碍抗凝血酶的识别。简化了抗凝低聚糖的使用。

我们还发现带有磺酸盐基团的氮原子可以被氧原子取代,从而进一步简化了制备过程。因此,在1987年与Constant van Boeckel和Dick Meuleman进行的研究中, 欧加农,我们获得了一系列具有不同寿命的抗血栓性五糖Xa因子抑制剂。一些正在临床试验中。

新型抗凝剂

与具有难以控制活性的凝血酶直接抑制剂不同,这些五糖具有的活性由循环抗凝血酶的量自动调节。因此避免了过量:身体消除了过量的五糖。

此外,我们的分子对抗凝血酶的亲和力使得几乎所有施用的分子都与该蛋白质相连,后者是蛋白质的靶标(其他抗凝剂使自身与各种蛋白质结合,有时会引起作用不必要的和不受控制的)。特别地,由于五糖的体积小且具有适当的电荷,因此它们不具有肝素及其衍生物的讨厌的副作用,因为它们不与血小板因子4(PF4)相互作用,一种蛋白质,与肝素复合时,可引发过敏反应,引起肝素治疗的严重副作用:血小板减少。

混合抑制剂

尽管已显示因子Xa抑制剂是极好的抗血栓形成剂,但在大鼠中的研究(其中血栓形成是通过结扎颈静脉而引起的)表明,如果将其抑制,则可以获得更有效的化合物。同时凝血酶和因子Xa。通过恢复合成糖的方法,我们寻找了这样的化合物:它们必须与抗凝血酶选择性结合,并且还必须抑制凝血酶和Xa因子,而不会由于分子上的负电荷而产生不良影响。 '肝素。

在体内,因子Xa和凝血酶通过两种不同的机制被抗凝血酶抑制。一方面,当我们确定的五糖结合抗凝血酶时,Xa因子的抑制是由抗凝血酶构象的变化引起的。另一方面,对凝血酶的抑制需要在抗凝剂,抗凝血酶和凝血酶之间形成具有三个伴侣的复合物。碳水化合物充当装配体的支撑。

凝血酶的结合是由抗凝剂的负电荷引起的静电吸引。由于碳水化合物上的负电荷越来越多,因此分子越长,这种吸引力越强。但是,正如我们已经看到的,诸如血小板减少作用的副作用也随着电荷和分子大小的增加而增加。因此,问题是:当这两个分子根据相同的原理相互作用时,我们能否合成一种与抗凝血酶结合,会被激活,并且宁可与凝血酶结合而不是与PF4结合的多糖。静电吸引?

为了开始这项工作,我们认为带有抗凝血酶结合位点的寡糖由于被磺化,因此具有通过静电力吸引凝血酶的必要元素。因此,这些位点的并置不仅应催化因子Xa的抑制,而且应抑制凝血酶:我们认为寡糖足够长,足以同时结合两种蛋白质。

为了简化化学问题,我们首先将通过组装三个拷贝的单个二糖构建的六糖用作抗凝血酶结合域:我们获得了具有以下缺点的第一系列分子:与带负电荷的蛋白质(特别是PF4)非特异性相互作用。这种特性令人望而却步,我们寻找了没有这种缺点的其他分子。然而,然后看来,目标分子应该由至少15至16个单糖的连接组成以抑制凝血酶。

然后,我们构建的分子具有一个与抗凝血酶结合的五糖位点(五糖DEFGH),该位点的一端被一系列磺化的葡萄糖亚基所扩展:因此,我们复制了电荷的分布,肝素,与凝血酶结合。 15、17和19亚基寡糖在抗凝血酶存在下抑制Xa因子和凝血酶……但它们仍与PF4相互作用。

我们是否会通过缩短分子来减少这种相互作用,以减少其负电荷的数量?这还不够。另外,我们决定从与抗凝血酶结合或与凝血酶结合均不涉及的部分除去电荷。这次我们获得了带有两个带电域的寡糖,被中性域隔开。这种变化不会降低抗凝活性(已测定 体外),但避免绑定到 pf4。此外,对大鼠的实验显示出对静脉和动脉血栓形成的有效活性。

新一代抗血栓药

因此,化学合成提供了可以随意调节其生物学特性的分子:通过改变结构的细节,可以获得具有适合于目标应用的寿命的抗血栓形成剂;选择对因子Xa的选择性或对凝血酶有作用的受控组合;避免与其他蛋白质的有害相互作用;最后,我们获得的产品比从动物器官中提取的产品受到更好的控制和安全。

我们已经看到,肝素和抗凝血酶的相互作用涉及一种特殊的五糖:分子在大约2.5纳米的长度上带有八个磺酸酯基和两个羧酸酯基是不够的。为了匹配蛋白质的受体位点,仍然需要正确地排列这些基团。导致这种相互作用的是存在的单糖的性质以及它们采用的构象。艾杜糖醛酸(G)起着重要作用,这似乎可以解释肝素,硫酸乙酰肝素和硫酸皮肤素的显着生物学特性,这是糖胺聚糖家族的三个成员,只有生化专家才能看到其功能的碳水化合物。在生物过程中。

包含艾杜糖醛酸的化合物的首次合成是发现这种单糖的特殊性的起点。通过核磁共振分析分子(在这种分析方法中,无线电波和磁场用于确定分子各个原子的环境;了解这些环境的性质后,我们发现了分子的结构):因此发现肝素的艾杜糖醛酸呈新形式(变形的船形),可确保与抗凝血酶的结合。

此外,现在已经清楚地确定了蛋白质和糖胺聚糖家族(肝素)的多糖之间的特异性相互作用。生物学家对生物体内的蛋白质与生物体外的分子之间的这种相互作用很感兴趣,认为该生物必须含有五糖,而五糖将成为该蛋白质的天然配体……而他们这样做。在表面上发现了排列在血管内侧的细胞。

因此,化学合成研究彻底改变了血栓形成的治疗方法以及对凝血机制的理解。特别是,不怀疑被认为具有机械支持作用的多糖可以充当生理调节剂。

毫无疑问,“自然界”在物种的整个进化过程中都没有保留如此复杂的分子,以致于它们在凝结生物学或其他事件中仅具有次要作用。细胞生命的重要方面。

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